Dag 4

Idag har vi slutligen avslutan våran southern blotting för att undersöka om vår LL-37 gen fanns i vår plasmidlösning från början.
Utifrån våran tidigare PCR kunde vi se att vi fått en produkt av våra primers som var rätt antal baspar långt. Vid en PCR finns det många faktorer som kan gå fel, blandannat fick vi en negativ kontroll som gav utslag vilket gör att vi inte med säkerhet kan veta om vi fann LL-37 genen för att den fanns i vår plasmid eller om den kommit dit via en carryover kontaminering.

På vårat resultat från southern blottingen syntes det ett band tydligt både vid koncentrationen av 0,5ng/mikro l och vid vår koncentration med 0,005ng/mikro l. Detta visar att southern blot är väldigt känsligt för även väldigt låga koncentrationer. Dock är en PCR även den väldigt bra på att detektera väldigt låga koncentrationer då det räcker med ett enda templat i röret för att vi ska få extremt många kopior.

Nackdelen med PCR skulle jag säga är att det lätt kan ske en kontaminering vid minsta lilla misstag, men till fördel så syns resultatet tydligt och en negativ och positiv kontroll minimerar risken att man tolkar resultatet
från en felaktigt genomförd PCR.

Southern blotting på andra sidan visar med tydlighet tack vare proberna att vi faktiskt fått den specifika genen vi vill ha och inte bara en produkt av samma storlek. Dessutom leder den till minimala skador från eventuell kontaminering.
Nackdelen med Southern blot är istället att den kräver mer arbete från din sida och har många tidsdödande steg.

Det viktigaste som jag kommer ta med mig från dessa 4 labbdagar är min utökade förståelse för de metoder som vi tidigare bara läst om samt kunskapen som krävs för att kunna utnyttja dem i praktiken.

Dag 2

Denna labbdag utfördes en PCR, en elektrofores samt klyvning av plasmider.

Vid PCRen använde vi oss av 3 separata rör, en negativ kontroll som inte ska innehålla något DNA och därmed inte borde ha någon amplifiering, en positiv kontroll som bör innehålla den gen vi vill amplifiera, samt ett rör innehållande våran plasmidlösning.

Dessa produkter användes sedan i vår elektrofores där vi undersöker om den eftersökta genen (LL-37) finns i vår plasmidlösning.
Resultatet av elektroforesen syns på bilden nedan, där vi från vänster tillsatt negativ kontroll, positiv kontroll, PCR produkten av vår plasmidlösning, markör IV, markör III och plasmidlösningen.

Som man klan se på bilden har vi fått resultat på alla 6 brunnar. Detta innebär att en carry-over kontaminering skett då den negativa kontrollen annars inte skulle haft något synbart resultat. Denna kontaminering kan ha skett i flertalet steg innan PCRen. Detta har troligtvis berott på att arbetsplatsen där vi skapat vår mastermix inte var helt rent, alternativt kan det ha skett en kontaminering i och med att vi använde oss av PCR-rör från vår vanliga labbsal och inte hade separata rör i det rena rum där vi skapade vår mastermix.
Vårat prov, vilket är i den tredje brunnen har ett något tydligare sträck vid ca 600bp vid jämförande med markör IV. Men i och med att det skett en kontaminering i den negativa kontrollen kan vi inte vara säkra på att detta är en produt från vår plasmidlösning eller om det är från en kontaminering.

Dag 1

 

Dag 1 har gått ut på att rena ut plasmid DNA ur e. coli bakterier. Detta utfördes genom att först lysera bakterierna för att få plasmiderna fria och sedan rensa bort celldebris och genomiskt DNA ur lösningen via centrifugering.
Sedan rensades RNA och mindre föroreningar bort med hjälp av ett silicamembran som fångar upp plasmiderna men släpper igenom mindre RNA och DNA sekvenser.

Resultatet från reningen kontrollerades sedan med hjälp av spektofotometri. Detta skedde genom mätning av absorbans vid 260nm och 280nm. Mätningen vid 260nm visar vår koncenration av plasmiderna och att ta kvoten ur a260/a280 kan man se eventuella proteinföroreningar. Ett resultat mellan 1,8 och 1,9 visar på ett rent prov, och då vårt resultat låg på 1,81 var plasmidlösningen troligtvis ren.

så har man en blogg......